Controlo do nemátode das lesões radiculares Pratylenchus penetrans: uma abordagem biotecnológica
Resumo
Os nemátodes fitoparasitas são responsáveis por grandes perdas em diversas culturas que chegam a atingir 118 milhares de
milhões de dólares/ano. Em termos de impacto económico, os nemátodes das lesões radiculares (NLR), Pratylenchus spp. estão em
3º lugar, o que está diretamente relacionado com o número de plantas hospedeiras, mais de 400 espécies vegetais (culturas
agrícolas importantes, ornamentais, e árvores de fruto, incluindo frutos secos). Prospecções efetuadas em Portugal revelaram a
presença de algumas espécies de Pratylenchus associadas a culturas importantes. Recentemente, quatro espécies de NLR foram
isoladas e identificadas a partir de amostras de raízes de batateira, colhidas nas principais regiões produtoras de batata em
Portugal. A espécie mais abundante foi Pratylenchus penetrans seguida de P. neglectus, P. crenatus e P. thornei, tendo estas últimas
sido encontradas pela primeira vez associadas a esta cultura no nosso país. Além destas espécies de NLR, uma nova espécie de
Pratylenchus, associada a danos severos na produção de bolbos florais (p. ex. Amaryllis), foi detetada em várias estufas em
Portugal, o que reforça a dimensão da ameaça que estas espécies constituem para a agricultura e floricultura. A resistência a
Pratylenchus spp. é muito limitada, uma vez que apenas alguns loci têm sido ligados à resistência/tolerância a algumas espécies de
NLR. As estratégias de controlo utilizando compostos químicos estão limitadas pela legislação em vigor. A maioria dos nematodicidas
não são específicos, são altamente tóxicos, e constituem uma forte ameaça para o ecossistema solo, água potável, bem como à
saúde humana. Presentemente, uma das áreas de investigação mais relevante é a identificação de genes do patogénio relacionados
com metabolismo e parasitismo, em que o seu silenciamento através do RNA de interferência (RNAi), promova efeitos letais ou
inibidores do seu desenvolvimento. Alguns dos resultados promissores no controlo de patogénios fitoparasitas, através de
silenciamento de genes via RNAi, incluem bactérias, fungos, oomicetas, insetos, e nemátodes, principalmente o nemátode-dasgalhas-
radiculares (Meloidogyne spp.) e o nemátode-dos quistos (Globodera e Heterodera spp.). Apesar do silenciamento de genes,
usando a tecnologia RNAi, já ter sido demonstrado em algumas espécies de Pratylenchus, apenas alguns genes (e.g. pat-10, unc-
87, Pv010 e eng-1) foram testados, o que reflete a necessidade de estudos mais alargados em relação a este grupo de fitoparasitas
tão importante. O objectivo principal deste projeto é identificar genes que codifiquem proteínas em P. penetrans que possam ser
utilizados como novos alvos para o desenvolvimento de estratégias de controlo mais específicas e eficientes. Os transcriptomas
globais envolvendo o parasita-hospedeiro constituem uma ferramenta excelente para fornecer uma visão integrada do diálogo
molecular estabelecido entre o patogénio e o hospedeiro e, em última análise, para a identificação das principais vias moleculares e
genes individuais envolvidos nessa interação. O nosso material de partida consiste em diferentes conjuntos de dados de
transcriptómica em larga escala gerados “in house” (“paired-end sequencing mRNA-seq”, Illumina) para P. penetrans: 1) a partir do
nemátode, e 2) a partir de plantas de soja infetadas com esta espécie, e que serão utilizados como base para a seleção de novos
genes-alvo. Adicionalmente, novos conjuntos de dados de transcriptoma serão obtidos da infeção da batateira por P. penetrans.
Neste contexto, o projeto envolve a implementação de abordagens biotecnológicas para o melhoramento de plantas, utilizando
dados de “mRNA-seq Illumina” para a identificação de novos genes-alvo e da tecnologia de silenciamento via RNAi para estudar a
sua ação como potencial nematodicida. A estratégia a utilizar ao longo deste projeto inclui o estudo dos níveis de expressão e
localização dos genes a serem silenciados no nemátode, e na produção de fragmentos de siRNA e dsRNA para o silenciamento
desses genes via ensaios in vitro, e posteriormente via planta, avaliando a sua eficiência na interrupção do desenvolvimento do
nemátode ou mesmo letalidade. Um outro aspeto relevante da proposta PratyTech é conhecer o perfil de expressão genética do
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nemátode ou mesmo letalidade. Um outro aspeto relevante da proposta PratyTech é conhecer o perfil de expressão genética do
hospedeiro e as alterações celulares que ocorrem após a infeção da batateira com P. penetrans, podendo providenciar informações
importantes sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesta cultura economicamente importante. A longo prazo, o nosso
objetivo é desenvolver metodologias alternativas e inovadoras que permitam a obtenção de culturas resistentes ao NLR para serem
aplicadas a culturas agrícolas (horticultura, floricultura e pomares), importantes não só em Portugal, mas também em outras partes
da Europa e do Mundo onde P. penetrans tenha impacto económico relevante.
Objetivos, atividades e resultados esperados/atingidos
One central idea of this project is the application of fundamental scientific knowledge towards the potential implementation in the
field to control such resilient plant pathogens. In the short term, in silico and in vitro analyses will be used to select and evaluate
RLN gene targets. In the long term, the project should reveal critical information, which can be exploited for future biotechnological
transformation of important economic crops, which are highly susceptible to RLN. Taking into account the knowledge achieved by
both UE and UC partners regarding this group of nematodes [3], and the strong preliminary data already generated (see annex 1),
the innovative nature and specific goals of this proposal are to:
1) Produce a list of new nematode gene targets that are transcriptionally active during the Pratylenchus penetrans-plant interaction,
to be specifically silenced by RNAi, without affecting other non-target organisms;
2) Compare gene expression profiles of two economic important crops (potato versus soybean) upon infection with Pratylenchus
penetrans;
3) Assess root lesion disease and nematode development in potato through time-course studies using anatomic and cellular
observations;
4) Validate functional information on critical genes for the development and parasitism of P. penetrans by RT-qPCR and in situ
hybridization;
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hybridization;
5) Study the potential of siRNA and dsRNA nematode gene targets as effective anti-nematode strategy;
6) Establish laboratory assays for delivery of dsRNA mediated by planta, for demonstration of proof-of-principle of a novel strategy
based on nematode RNAi silencing, for the management of RLN.