Evolução de genes simbióticos em rizóbios: mesorizóbios de grão-de-bico como caso de estudo

O actual incentivo a práticas agrícolas mais sustentáveis está a revitalizar a importância da fixação biológica do azoto, aumentando a necessidade de conhecer melhor as simbioses rizóbios-leguminosas, particularmente as que envolvem culturas importantes em termos de alimentação e forragem. O grão-de-bico é uma destas leguminosas, sendo a terceira leguminosa para grão a nível mundial com uma produção de 9.8 milhões de toneladas em 2009 (dados FAO).

Os nossos projectos anteriores permitiram a investigação da diversidade e a caracterização de rizóbios capazes de nodular grão em solos portugueses [1, 2]. Um rastreio nacional mostrou que todos os isolados de rizóbio de grão pertencem ao género Mesorhizobium, mas a diversidade de espécies é elevada [PP2, PP5]. De facto, a maioria dos rizóbios isolados pertencem a espécies de Mesorhizobium diferentes de M. ciceri e M. mediterraneum, que eram considerados os microssimbiontes típicos de grão.

A gama de hospedeiros, i. e., o conjunto de leguminosas que uma estirpe de rizóbio é capaz de nodular está geralmente relacionado com a natureza dos factores Nod de rizóbio. Estas moléculas são sintetizadas por proteínas codificadas pelos genes de nodulação sendo muito importantes na interacção inicial planta-bactéria [3]. Vários estudos indicam que os genes nod têm sido transferidos horizontalmente entre espécies de rizóbios e, por isso, rizóbios pouco aparentados possuem genes nod similares.

O grão tem sido considerado um hospedeiro de nodulação restrito, principalmente porque não é nodulado pelas estirpes de rizóbios de gama larga de hospedeiros [4]. Estudos anteriores em rizóbios de grão portugueses mostraram que os genes simbióticos (nodC e nifH) são muito conservados entre as diferentes espécies de Mesorhizobium [PP4], indicando também que o grão é um hospedeiro restrito. Como evoluíram estas características? Uma grande diversidade de espécies de rizóbio capazes de nodular grão, mas ao mesmo tempo contendo genes simbióticos muito conservados, parece contraditório. Para além disto, não é conhecido nenhum rizóbio de grão capaz de nodular uma outra leguminosa [5]. Mais ainda, isolados M. ciceri de Biserrula pelecinus não são capazes de nodular grão [6].

O modo como as populações de rizóbio evoluem e se diversificam nos solos e quais são as forças motoras dessa evolução são ainda assuntos bastante desconhecidos. Alguns casos particulares de leguminosas introduzidas em países onde se verificou a ausência total de rizóbios capazes de nodular essas leguminosas gerou condições excepcionais para o estudo da evolução dos rizóbios. Os casos mais interessantes são a introdução da soja no Brasil [7] e da biserrula na Austrália. Este último exemplo é particularmente relevante para o presente estudo, uma vez que a biserrula é nodulada por M. ciceri, uma espécie que tipicamente nodula grão. Cinco anos foram suficientes para detectar rizóbios capazes de nodular biserrula, distintos da estirpe inoculante original, em solos australianos [8]. Isto significa que os rizóbios nativos foram capazes de evoluir e adquirir, por transferência lateral, o conjunto de genes que permitiram a infecção da leguminosa introduzida. Apesar de os novos isolados terem adquirido a ilha simbiótica do inoculante original, têm uma baixa eficiência em termos de fixação de azoto [8].

O nosso principal objectivo é o estudo dos genes simbióticos e assim compreender a evolução da simbiose leguminosa-rizóbio, tendo como caso de estudo um hospedeiro restrito para a nodulação, o grão-de-bico. Primeiramente será avaliada a gama de hospedeiros da nossa colecção de isolados nativos de rizóbio de grão, seguida da sequenciação completa de ilhas ou plasmídeos simbióticos. Genes simbióticos organizados em ilha simbiótica parece ser uma característica de Mesorhizobium, por isso é esperado que os rizóbios de grão também possuam essa região cromossomal. A análise comparativa de genes simbióticos (p.ex. estudos de filogenia e sintenia) conjuntamente com a sua análise funcional (mutação knockout, sobrexpressão e análise transcricional) permitirá compreender os mecanismos moleculares subjacentes à especificidade grão-rizóbio. Finalmente, propomos transformar geneticamente uma estirpe incapaz de nodular grão num microssimbionte de grão.

O presente projecto representa o primeiro estudo exaustivo de genes simbióticos de rizóbio de grão, tentando clarificar a evolução dos mesmos e compreender como um hospedeiro restrito é nodulado por um grande número de espécies de Mesorhizobium. Em suma, os nossos resultados poderão contribuir para um maior conhecimento da evolução de genes simbióticos em rizóbios.