Melhoramento de rizóbios por modificação genética com genes de resposta ao stress

A simbiose entre bactérias do solo (rizóbios) e plantas leguminosas (feijão, lentilhas, grão-de-bico, etc) fornece azoto à planta através da fixação biológica do azoto, aumentando a produtividade das culturas e atenuando a necessidade de fertilizantes. Os rizóbios têm sido usados como inoculantes seguros em agricultura sustentável e ecológica, em alternativa aos fertilizantes ambientalmente prejudiciais, utilizados na agricultura convencional. As bactérias usadas como inoculantes devem ser simbioticamente eficientes bem como adaptadas às condições ambientais, tais como extremos de temperatura, pH do solo ou salinidade. Assim, o conhecimento das bases moleculares da eficiência simbiótica e da tolerância ao stress é fundamental para o melhoramento de inoculantes de rizóbio, nomeadamente por transformação genética. Os genes de resposta ao stress (stress response genes, SRG) estão envolvidos na resposta das células a diferentes tipos de condições de stress. Quando submetidas a aumento de temperatura brusco, as bactérias revelam a indução de SRGs, incluindo genes de proteínas de choque térmico (heat shock proteins, Hsps) como os chaperones moleculares GroES/L e DnaK/J, pequenas Hsps e proteases. O conhecimento de SRGs em rizóbio tem aumentado mas pouco se sabe ainda acerca dos mecanismos de resposta ao stress. Os nossos estudos anteriores resultaram no isolamento de estirpes nativas de rizóbio de grão-de-bico tolerantes a stress ambiental, nomeadamente acidez, calor e salinidade. Todos os isolados pertencem ao género Mesorhizobium, especificamente M. tianshanense, M. loti e outras espécies, para além dos microsimbiontes de grão-de-bico esperados, M. ciceri e M. mediterraneum. Dentro da mesma espécie encontrámos estirpes tolerantes e estirpes sensíveis ao stress. O presente projecto é a continuação óbvia do anterior, focando as bases moleculares da tolerância ao stress ambiental em rizóbio. Os diferentes níveis de tolerância apresentados pelas estirpes nativas de Mesorhizobium podem ser devidos a diferenças quantitativas ou qualitativas ao nível dos SRGs. Para compreender os mecanismos de resposta ao stress em rizóbio, a expressão global diferencial dos genes de Mesorhizobium loti sob stress (alta temperatura, baixo pH e salinidade) está a ser avaliada através da análise por microarrays do transcriptoma. M. loti MAFF303099 é a única espécie de Mesorhizobium cujo genoma completo está publicado. Assim, microarrays de DNA de M. loti podem ser utilizados como ferramenta para a análise sistemática da expressão dos genes na resposta desta bactéria ao stress. Para investigar as diferenças entre os mecanismos de resposta ao stress de mesorizóbios de grão-de-bico tolerantes e sensíveis, estamos também a examinar SRGs específicos, no que respeita à sequência, organização de genes, análise da expressão e análise funcional. Estes genes incluem dnaK/J e groeS/L (stress de temperatura), actA e actP (stress de acidez), exoN e exoY (stress osmótico), o gene regulador rpoH e novos SRGs identificados pela análise de microarrays de M. loti. A análise da expressão de SRGs específicos, por Northern blot e RT-PCR, tem revelado a indução diferencial de genes, clarificando assim a resposta transcripcional de estirpes tolerantes e sensíveis ao stress. A análise funcional de SRGs specíficos, usando mutantes knockout de rizóbio ou sobreexpressão de genes em rizóbio, pode elucidar o seu papel no mecanismo de resposta a diferentes condições de stress. Adicionalmente, a análise funcional de SRGs, em particular de genes de chaperons, pode clarificar a sua contribuição para a nodulação e fixação de azoto, mediante avaliação da eficiência simbiótica das estirpes após sobreexpressão dos referidos genes. A identificação de determinantes genéticos de tolerância ao stress, em M. loti e em mesorizóbios nativos, é fundamental para o melhoramento de estirpes por modificação genética, de modo a obter rizóbios inoculantes para grão-de-bico, não apenas simbioticamente eficientes mas também tolerantes a condições de stress ambiental. Rizóbios melhorados, com maior tolerância a stress, estão a ser construídos por transformação genética de rizóbios com um vector de expressão estável como o RK2, contendo SRG previamente reconhecido como determinante para a tolerância a stress. O resultado da sobreexpressão de SRGs heterólogos, nomeadamente genes de chaperons de bactérias termofílicas, está também a ser investigado. Este projecto pretende contribuir para a compreensão dos mecanismos de resposta ao stress em rizóbio. Inclui a análise do transcriptoma de M. loti sob stress bem como a análise de SRGs específicos em mesorizóbios de grão-de-bico nativos, tolerantes a stress. Finalmente inclui o melhoramento de rizóbios por modificação genética com SRGs. Globalmente este projecto pode contribuir para aplicações microbiológicas eficientes, melhorando a interacção planta-microrganismo-ambiente, num contexto de agricultura sustentável e ecológica.