Análise Bioquímica I
Apresentação
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável
Objetivos de Aprendizagem
Conhecer e compreender a informação teórica e experimental no domínio da Análise Bioquímica que inclua termos, conceitos, fatores, princípios, leis, teorias, métodos e procedimentos relativos à planificação de experiências, avaliação e controlo de resultados experimentais, assim como às técnicas de centrifugação, eletroforese e cromatografia líquida e gasosa de eficácia elevada. Conhecer e compreender aplicações em bioquímica da espectrometria de fluorescência. Desenvolver o sentido crítico para equacionar novos problemas no domínio da Análise Bioquímica que envolva técnicas aprofundadas, ou estudadas pela primeira vez nesta unidade curricular que permitam a conceção de novas estratégias experimentais com aplicação em Bioquímica. Aplicar os conhecimentos adquiridos a novas situações no que se refere ao planeamento de experiências à análise e controlo da qualidade dos resultados. Executar rigorosamente, procedimentos experimentais que permitam caracterizar biomoléculas sob o ponto de vista estrutural e funcional, interpretar e discutir resultados assim como elaborar relatórios. Capacitar para delinear em equipa, recorrendo a bases de dados, planos de trabalho laboratoriais que permitam ampliar o conhecimento em bioquímica e suas aplicações na gestão laboratorial.
Conteúdos Programáticos
Aulas teóricas
1.Apresentação, programa, funcionamento da disciplina e avaliação. Acerto das datas de avaliação. Bases de dados para pesquisa bibliográfica. Motores de busca mais utilizados em Análise Bioquímica.
2.Delineamento experimental e técnicas de amostragem. Recolha e preparação de amostras. Controlo da qualidade dos resultados, análise de variância. Análise de correlação. Planificação de experiências.
3.Aplicações da espectrometria de fluorescência em análise bioquímica. Transições eletrónicas em fotoluminescência. Relação potência da fotoluminescência-concentração. Fatores que afetam a fotoluminescência. Rigidez estrutural. Hetero-átomos e grupos substituintes. Fatores ambientais. Aparelhos de leitura da fotoluminescência. Fontes de excitação, seletores de comprimentos de onda, células. Detetores. Espectros de fotoluminescência. Análise por fotoluminescência. Doseamentos por espectrometria de fluorescência em misturas. Interferências. Espectrometria de Fosforescência.
4.Centrifugação e ultra-centrifugação. Princípios gerais. Centrifugação analítica. Velocidade de sedimentação. Equação de Svedeberg. Equilíbrio de sedimentação. Centrifugação preparativa. Centrifugação em gradiente. Fracionamento subcelular e localização enzimática. Filtração, Diálise.
5.Métodos eletroforéticos. Princípios gerais. Eletroforese livre. Eletroforese zonal. Meios de suporte usualmente utilizados. Eletroforese em papel, em acetato de celulose, em SDS-PAGE e em agarose. Sistemas tampão utilizados em eletroforese. Efeito dos tampões na integridade molecular das proteínas. Efeito das propriedades iónicas dos tampões. Escolha do sistema tampão. Revelação dos géis. Fatores a considerar para a realização de uma eletroforese. O pH das soluções. Parâmetros elétricos. Temperatura. Duração da eletroforese. Concentração proteica das amostras. Qualidade das amostras. Dimensão da amostra. Qualidade dos reagentes. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Perspetiva histórica. Equipamento utilizado. Preparação de um gel. Materiais. Montagem do molde. Preparação da mistura do gel. Preparação da amostra. Revelação e conservação do gel. Dificuldades técnicas em PAGE.
6.Focagem isoelétrica. Introdução. Anfólitos transportadores. Escolha de uma matriz de suporte de poliacrilamida e de agarose. Equipamento. Montagem do sistema. Preparação da amostra. Aplicação da amostra. Posição de aplicação. Corrida do gel, condições da corrida. Deteção da amostra e conservação do gel. Fixador e corantes. Eletroforese capilar de elevada eficácia.
7.Métodos cromatográficos. HPLC. Princípios gerais. Mecanismos de retenção. Taxa de fluxo linear. Porosidade e permeabilidade. Resolução. Dependência da largura de banda com o tamanho da partícula. Condições ótimas de análise e tempo de análise. Equipamento. Reservatórios dos solventes. Bomba. Técnicas de introdução da amostra. Instrumentação para eluição por gradiente. Colunas. Materiais para cromatografia de adsorção e partição, suportes químicos modificados, permutadores iónicos, fases estacionárias para cromatografia de exclusão. Forma, interligações e empacotamento. Caracterização e teste das colunas. Controlo e estabilização da temperatura. Medição da taxa de fluxo. Detetores. Detetores de absorção molecular, refratómetro diferencial, detetor de micro-adsorção, detetor de ionização de chama, detetor de fluorescência, detetor electroquímico, detetor de condutividade, detetor de capacidade, detetor de radioatividade, detetor de infra-vermelhos. Técnicas hifenadas. Coletor de frações. Registadores. Segurança. Aplicações. Separação de intermediários metabólicos e de componentes da matéria viva
8.Métodos cromatográficos. GC. Princípios básicos. Picos de retenção. Resolução. Caracterização dos picos. Parâmetros da coluna. Determinação experimental do número de pratos teóricos. Simbologia. Tecnologia das colunas. Química das matrizes das colunas. Preparação das colunas. Fases estacionárias. Avaliação da qualidade da coluna. Cromatógrafo. Componentes básicos. Controlo do fluxo do gás de arrasto e determinações. Controlo da temperatura da coluna. Sistemas de injeção. Detetores. Sistemas de aquisição de resultados. Aspetos práticos. Caracterização da amostra. Caracterização da seringa. Caracterização do septum. Temperatura de amostragem. Temperatura do injetor. Seleção da coluna. Seleção e determinação do gás de arrasto. Programação do fluxo do gás de arrasto. Aplicações. Combustíveis fósseis, alimentos, cosmética. Material biológico.
Aulas Práticas
§ Reações coradas de aminoácidos e proteínas
§ Determinação espectrofotométrica da concentração de citocromo b5 da fração microssomal do fígado de rato
§ Determinação espetrofluorimétrica da riboflavina
§ Determinação espetrofluorimétrica da tiamina
§ Determinação do ponto isoelétrico da albumina do soro bovino
§ Doseamento da terbutilazina em amostras de água por HPLC
§ Separação de óleos essenciais por GC
Métodos de Ensino
Avaliação
De acordo com o regulamento escolar interno as aulas teóricas e práticas são de frequência obrigatória para todos os alunos inscritos na disciplina.
A avaliação dos alunos nesta disciplina possuirá duas componentes:
-teórica que inclui a elaboração, apresentação oral e discussão de um protocolo de aula prática no domínio das técnicas analíticas abordadas, complementada por um teste escrito para avaliação dos fundamentos teóricos adquiridos;
-experimental correspondente à preparação, execução laboratorial, respetivos relatórios e apresentação oral que funcionará em regime de avaliação contínua ao longo do semestre.
Os alunos trabalhadores-estudantes que não possam comparecer às aulas laboratoriais, de acordo com a lei, terão de submeter-se a um exame laboratorial e realizar as provas da componente teórica.
Modalidades de classificação
A avaliação para classificação da componente teórica será efetuada por meio de apreciação da componente escrita de um protocolo no domínio das técnicas estudadas, da sua apresentação oral e discussão pública. Os alunos resolverão um teste no final do semestre tendo aprovação se obtiverem pelo menos a classificação de 10 valores em qualquer dos instantes de avaliação.
A avaliação corrente para classificação da componente experimental será efetuada numa escala de 0 a 20 valores, por integração dos resultados da avaliação quantitativa efetuada nas aulas, tendo em conta a preparação das aulas práticas, os relatórios elaborados pelos alunos durante as mesmas, os resultados da observação por escalas, do trabalho dos alunos efetuado no decorrer das aulas práticas e a apresentação oral dos resultados experimentais. Os alunos só terão aprovação se também obtiverem pelo menos a classificação de 10 valores na componente prática.
Os alunos que obtiverem frequência prática, mas não obtiverem nota para aprovação, poderão efetuar um exame laboratorial que incidirá sobre toda a matéria relativa aos trabalhos laboratoriais realizados.
Cálculo da nota final
A nota final corresponderá à soma de 50% da classificação da componente teórica com 50% da componente experimental. A classificação da componente teórica corresponderá a 50% da classificação obtida com o protocolo e 50% da classificação obtida no teste.
A classificação da componente experimental corresponderá à soma de 60% da classificação obtida na avaliação qualitativa efetuada nas aulas, tendo em conta os relatórios elaborados pelos alunos durante as mesmas e os resultados da observação por escalas do trabalho dos alunos efetuado no decorrer das aula práticas, com 40% da classificação obtida na apresentação oral dos resultados.
Bibliografia
Skoog, D.A., Holler, F.J. and Crouch, S.R. (2018) Principles of instrumental analysis, 7th ed., CENGAGE Learning, Boston.
Uchiyama, S., Arisaka, F., Stafford, W.F. and Laue, T. (2016) - Analytical Ultracentrifugation: Instrumentation, Software, and Applications, Springer Verlag, Tokyo.
Corradini, D. (2016) - Handbook of HPLC, 2nd edition, CRC Press. London.
Venn, R. (2000) - Principles and Practice of Bioanalysis, Taylor & Francis, London.
Holme, D. J. and Peck, H. (1998) - Analytical biochemistry, Longman Scientific and technical, Essex
